Питательные среды

Для лабораторных сред применяют дистиллированную воду с электропроводностью не выше 2 мкСм/см либо деионизованную воду степени очистки I–II. Водопроводная и артезианская вода допустимы только в производственных прописях (например, в модифицированной среде Заррука), где её жёсткость учитывают, снижая дозу CaCl₂.
Свежедистиллированную воду перед приготовлением олиготрофных сред (Chu-10, ASM-1, WC) выдерживают 1–2 суток: это удаляет растворённый CO₂ и стабилизирует pH.
Природную морскую воду отбирают вдали от берега, фильтруют через 0,45 мкм, выдерживают в темноте 2–4 недели («старение») и повторно фильтруют через 0,22 мкм. Старение необходимо для минерализации растворённой органики.

2. Порядок растворения солей

Универсальное правило: соли вносят по одной, в максимально разбавленный раствор, полностью растворяя предыдущую навеску перед добавлением следующей. Концентрированные маточные растворы никогда не смешивают напрямую друг с другом.
Соли кальция (CaCl₂, Ca(NO₃)₂) вносят ПОСЛЕДНИМИ — после фосфатов и карбонатов, при интенсивном перемешивании, в объёме не менее 80 % от конечного. Нарушение порядка даёт белую муть Ca₃(PO₄)₂ и CaCO₃, необратимо выводящую из среды фосфор и кальций.
Соли железа вносят только вместе с хелатором (ЭДТА, цитрат, NTA), предварительно смешав их в отдельной порции воды и выдержав 20–30 мин до полного комплексообразования — до появления устойчивой жёлтой окраски без осадка.
Силикаты (Na₂SiO₃·9H₂O) вносят в самом конце и только в среду, доведённую до рабочего pH: в кислой среде выпадает аморфный SiO₂, недоступный диатомовым.
Бикарбонат натрия вносят последним или готовят отдельным раствором — особенно при совместном присутствии кальция.

3. Маточные (концентрированные) растворы

Большинство сред удобнее готовить не из сухих навесок, а из маточных растворов кратности ×100 … ×1000: навеску 6 мг взвесить точно невозможно, а отмерить 1 мл раствора 6 г/л — легко.
Правило раздельного хранения: фосфаты, соли кальция, карбонаты и растворы железа хранят в РАЗНЫХ флаконах. Совмещение в одном стоке гарантированно даёт осадок.
Срок годности: макросоли — 6–12 мес. при 4 °C; растворы железа — 3–6 мес. (обновлять при появлении бурой взвеси); витамины — 6 мес. при −20 °C.
Маркировка обязательна: шифр раствора, дата приготовления, срок годности, фамилия исполнителя. Растворы хранят в стекле тёмного цвета; пластик допустим для микроэлементов, но не для растворов ЭДТА длительного хранения.

4. Коррекция pH

pH доводят ПОСЛЕ внесения всех компонентов, но ДО стерилизации, разбавленными растворами 1 М NaOH (KOH) или 1 М HCl. Концентрированные кислоты и щёлочи вызывают локальное выпадение осадка в точке внесения.
Автоклавирование смещает pH: у сред с бикарбонатом (Заррука, SOT) — вверх на 0,5–1,0 единицы вследствие разложения NaHCO₃ и потери CO₂; у сред с органическими буферами — обычно вниз на 0,1–0,3 единицы. Целевое значение задают с учётом этого сдвига.
Буферные системы: фосфатный буфер (BBM), Tris 10–20 мМ (TAP, WC, Provasoli), HEPES 10 мМ (модификации BG-11), карбонатно-бикарбонатный (BG-11, Заррука). Tris и HEPES не автоклавируют совместно с сахарами.

5. Стерилизация

Автоклавирование: 121 °C, 1 атм избыточного давления, 15–20 мин для объёмов до 1 л; 25–30 мин для 2–5 л. Превышение времени вызывает карамелизацию агара и разложение бикарбоната.
Стерильная фильтрация (мембрана 0,22 мкм) ОБЯЗАТЕЛЬНА для: витаминов, глюкозы и других органических субстратов, растворов бикарбоната, гипергалинных сред (среда Джонсона), морской воды с силикатом.
Раздельная стерилизация: несовместимые компоненты (бикарбонат + кальций; фосфаты + кальций; сахара + аминокислоты) автоклавируют в отдельных сосудах и сливают асептически только после полного охлаждения до комнатной температуры.
Пастеризация (80 °C, 30 мин, трёхкратно с интервалом 24 ч) — щадящая альтернатива для морской воды, сохраняющая карбонатное равновесие.

6. Агаризованные среды

Концентрация агара: 10–12 г/л для чашек, 6–8 г/л для полужидких сред, 15 г/л для скошенных агаров в пробирках. Применяют бактериологический или очищенный агар; технический агар содержит ингибирующие примеси.
Агар автоклавируют ОТДЕЛЬНО в двойном объёме воды, среду готовят двукратной концентрации и смешивают при 45–50 °C. Совместное автоклавирование с фосфатами и кальцием даёт мутные пластины и снижает всхожесть колоний.
Для цианобактерий в агар добавляют 0,3 г/л Na₂S₂O₃·5H₂O: тиосульфат нейтрализует продукты термического разложения агара, тормозящие рост.
Пластины подсушивают в ламинарном боксе 20–30 мин крышкой вниз и хранят при 4 °C в темноте не более 3–4 недель.

7. Инокуляция и условия культивирования

Объём инокулята — 5–10 % от объёма среды; стартовая плотность 10⁵–10⁶ кл/мл. Слишком малый инокулят удлиняет лаг-фазу, слишком большой быстро исчерпывает биогены.
Освещённость: 20–50 мкмоль фотонов·м⁻²·с⁻¹ для поддержания коллекций, 100–200 — для накопительных культур, до 500 — для индукции каротиногенеза. Фотопериод 12:12 или 16:8, для многих цианобактерий — непрерывный свет.
Температура: 20–25 °C для большинства пресноводных форм, 28–35 °C для Arthrospira и Chlorella sorokiniana, 45–55 °C для термофильных цианобактерий, 15–20 °C для полярных и холодноводных штаммов.
Пересев коллекционных культур — раз в 4–8 недель. Для длительного хранения применяют криоконсервацию (10 % ДМСО или 5 % метанол, −196 °C) либо иммобилизацию в агаре под слоем минерального масла.

8. Типичные ошибки и их признаки

Белая муть сразу после смешивания — выпадение фосфата или карбоната кальция: нарушен порядок внесения солей либо смешаны концентраты.
Бурые хлопья, ржавый осадок на дне — гидролиз железа: недостаточно хелатора, просроченный раствор Fe или слишком высокий pH в момент внесения.
Отсутствие роста при внешне нормальной среде — разрушенные при автоклавировании витамины, отсутствие источника углерода в закрытом сосуде без продувки либо остаточный нитрат в «безазотной» среде.
Побурение и лизис культуры через 3–5 суток — исчерпание буферной ёмкости и защелачивание выше pH 10 вследствие фотосинтетического потребления CO₂.
Хлороз (пожелтение) культуры — азотное или железное голодание; при азотном голодании у цианобактерий дополнительно происходит деградация фикобилисом.

З. Источники прописей

Bischoff H. W., Bold H. C. Phycological studies IV. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. Univ. Texas Publ. 6318. 1963. P. 1–95.

Bolch C. J. S., Blackburn S. I. Isolation and purification of Australian isolates of the toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa Kütz. // J. Appl. Phycol. 1996. Vol. 8. P. 5–13.

Borowitzka M. A., Borowitzka L. J. (eds.) Micro-algal Biotechnology. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1988. 477 p.

Castenholz R. W. Thermophilic blue-green algae and the thermal environment // Bacteriol. Rev. 1969. Vol. 33. P. 476–504.

Chu S. P. The influence of the mineral composition of the medium on the growth of planktonic algae // J. Ecol. 1942. Vol. 30. P. 284–325.

Costa J. A. V., Colla L. M., Duarte Filho P. F. Improving Spirulina platensis biomass yield using a fed-batch process // Bioresour. Technol. 2004. Vol. 92. P. 237–241.

Gorham P. R., McLachlan J., Hammer U. T., Kim W. K. Isolation and culture of toxic strains of Anabaena flos-aquae // Verh. Int. Ver. Limnol. 1964. Vol. 15. P. 796–804.

Gorman D. S., Levine R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi // PNAS. 1965. Vol. 54. P. 1665–1669.

Guillard R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates // Culture of Marine Invertebrate Animals. New York: Plenum Press, 1975. P. 26–60.

Guillard R. R. L., Ryther J. H. Studies of marine planktonic diatoms // Can. J. Microbiol. 1962. Vol. 8. P. 229–239.

Guillard R. R. L., Lorenzen C. J. Yellow-green algae with chlorophyllide c // J. Phycol. 1972. Vol. 8. P. 10–14.

Harrison P. J., Waters R. E., Taylor F. J. R. A broad spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton // J. Phycol. 1980. Vol. 16. P. 28–35.

Johnson M. K., Johnson E. J., MacElroy R. D. et al. Effects of salts on the halophilic alga Dunaliella viridis // J. Bacteriol. 1968. Vol. 95. P. 1461–1468.

Kester D. R., Duedall I. W., Connors D. N., Pytkowicz R. M. Preparation of artificial seawater // Limnol. Oceanogr. 1967. Vol. 12. P. 176–179.

Kotai J. Instructions for preparation of modified nutrient solution Z8 for algae. Publ. B-11/69. Oslo: NIVA, 1972.

Provasoli L. Media and prospects for the cultivation of marine algae // Cultures and Collections of Algae. Japan. Soc. Plant Physiol., 1968. P. 63–75.

Rippka R., Deruelles J., Waterbury J. B., Herdman M., Stanier R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria // J. Gen. Microbiol. 1979. Vol. 111. P. 1–61.

Stanier R. Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales) // Bacteriol. Rev. 1971. Vol. 35. P. 171–205.

Tamiya H., Hase E., Shibata K. et al. Kinetics of growth of Chlorella // Algal Culture from Laboratory to Pilot Plant. Washington: Carnegie Inst., 1953. P. 204–232.

Vonshak A. (ed.) Spirulina platensis (Arthrospira): Physiology, Cell-biology and Biotechnology. London: Taylor & Francis, 1997. 233 p.

Walne P. R. Studies on the food value of nineteen genera of algae to juvenile bivalves // Fish. Invest. Ser. 2. 1970. Vol. 26. P. 1–62.

Waterbury J. B., Watson S. W., Valois F. W., Franks D. G. Biological and ecological characterization of the marine unicellular cyanobacterium Synechococcus // Can. Bull. Fish. Aquat. Sci. 1986. Vol. 214. P. 71–120.

Zarrouk C. Contribution à l'étude d'une cyanophycée: influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la croissance et la photosynthèse de Spirulina maxima. Thèse. Paris: Univ. de Paris, 1966.

Каталоги коллекций культур: UTEX (Техасский университет), CCAP (Великобритания), SAG (Гёттинген), CCMP/NCMA (Бигелоу), ATCC (Manassas), ANACC (Австралия), NIVA (Норвегия).